IGEM:Peking/2007/Switch:Miller
Day 1
1. 检查要用的试剂是否量够：
- D medium（一次活化、二次活化、稀释和空白对照要用）；
- Z buffer（配比时要用）；
- 氯仿、0.1%SDS（裂菌时要用）；
- 4mg/ml ONPG（反应物）；
- 1mM Na2CO3（终止反应要用）
- 如果有不够的，赶紧配好，灭菌或滤菌；
2. 灭菌：短试管（不带试管帽）；
- Tube（离心用）；
- 锥形瓶（二次活化maybe会用到）；
- 带刻度试管（稀释时量取D medium用）；
- 枪头：大枪头（用的较多，多多益善啦），中枪头（用的不多，1-2盒吧），小枪头（诱导时可能会用到，当然超净台里应该会有的^__^）
- 50ml塑料离心管（稀释时用到，根据实验需要看灭多少吧）
3. 挑MG1655划线扳子的单菌落到装有1ml D medium的试管中，一次活化摇菌过夜；
Day 2
1:100稀释到新的试管中，诱导组加IPTG（final concentration=1mM），二次活化摇菌到OD600=0.28—0.7（这次实验摇到了0.41，约4个半小时）；如果二次活化体积过大，应选用100ml锥形瓶；（快诱导好的时候就可以准备要拿到王博那做实验的东西啦~）
4. 试管和做稀释用的50ml离心管放在冰中，使细菌停止生长；
5. 按所需比例用D medium稀释菌液；
6. 分光光度计测量稀释后的OD600，如过测量不准，则根据稀释倍数计算即可；
- 拿着东西赶紧跑到生技楼王忆平老师实验室：
试管、tube、tube架（也可用王博那的）、菌液、1ml和200ml的微量移液器、大中枪头、试管架至少两个、timer、D medium（分装出一些配空白对照时用）、Z buffer、氯仿、01% SDS、4mg/ml ONPG、1mM Na2CO3。
7. 打开水浴，调节水温到28度，如果温度过高可用冰调节，取冰地点见下面提示；
8. 摆好试管，将菌液和Z buffer按照所需配比混合，每管总体积为2ml，空白组每种配比做两管，用D medium与Z buffer混合，；
9. 每管加入200ul氯仿和100ul 0.1% SDS，vertex 10s，28度水浴5min；
10. 每管加入400ul 4mg/ml ONPG，从加入第一管开始计时，每隔10s加入下一管，每加入一管立即vertex混匀，加下一管的同时将上一管放入28度水浴开始反应，开始反应时间为t0+10s；（t0可以事先就根据准备加入反应液的顺序写好的）
11. 待溶液出现足够的黄色，加入1ml Na2CO3终止反应，记录此时的时间t，反应时间即为[t-(t0+10)]s；
12. 将试管内的液体倒入tube，做好标记后，13000rpm离心3min，
13. 吸上清到事先洗好的比色杯中，测量OD550、OD420；
14. 按照公式 Unit=[(OD420-1.75*OD550)/t*v*OD600]*1000计算半β- 乳糖甘酶的活性单位。
王博那的分光光度计的使用方法
1：打开开关，在分光光度计背面；
2：等待机子启动完毕，出现下面页面：
- Fixed
- Scan
- …
3：按向下移动键，选择Scan，按enter键，出现下面页面：
4：需要调节三项：
5：将比色杯放入样品槽，其中空白为右上角和1号样品槽，其他依次放入；（注意： 右上交的空白组光面朝自己，1-7号光面朝两侧，观察好光路不要放错。）
6：按Zero键，机子根据空白参比调零，到页面下方waiting字样消失即可；
7：按Run键，机子开始测量1-7号样品的OD550、OD420，并依次出现显示屏上，可等测量完毕，依从上行键依次记录结果；
8：第二批样品加入后，如未换空白组样品，则不需要重新调零，结果会从8-…显示，8号即为1号空白样品，依次类推，不要记错实验结果；
9：按Stop键停止反应，如不需要保存实验结果，不用按save results键，直接按Home键回到主页，取出比色杯，关掉电源即可；
10：比色杯用蒸馏水清洗干净，卫生纸上控干。
提示
1：生计楼地下一层有制冰机，可以去那里取冰以调节水浴温度；
2：水浴旁边要准备好vertex，调节到touch模式，方面实验操作；
3：反应时，可打开分光光度计开关，启动需要一段时间，启动完毕后调节响应选项；
4：离心的时候准备好比色杯；
5：测量之前，用擦镜纸将比色杯光面两测擦拭干净。
