Introsynbio:Modulo 1:Dia1
Modulo 1: Principios de Ingeniería Genetica
Preparación de Medios de Cultivo y Preparación de Celulas Competentes
Medios de Cultivos Utilizados en Ingeniería Genética
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de estos es tan grande que la variedad de medios de cultivo es enorme, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos, ni siquiera refiriendonos a las bacterias con exclusividad.
No obstante, apesar de esto,el medio de cultivo LB (Luria Bertani) es el medio utilizado por excelencia para el mantenimiento de las cepas de E.coli recombinante en procesos de microbiología molecular e ingeniería genetica. Este medio contiene peptona de caseína y extracto de levadura que proporcionan al medio los nutrientes necesarios para el desarrollo óptimo de la mayoría de los microorganismos.
Células Competentes
La transformación de células competentes, es el proceso gracias al cual podemos introducir nuestro plásmido en la bacteria. La competencia es un estado fisiológico especial que presentan algunas bacterias deforma natural, y que podemos inducir en otras, y que las hace especialmente permeables a la entrada de plásmidos. Esta permeabilidad se debe a alteraciones que sufre la membrana celular.
En Clase
Parte 1:Preparación del Medio de Cultivo
Materiales
- Agua destilada Esteril
- Agar Bacteriológico
- Matraz de 1 litro
- Antibiotico( Cloranphenicol - Stock25mg/ml)
- Autoclave
- Micropipetas 10-100ul, 100-1000ul
- Puntas Esteriles 10-100ul, 100-1000ul
- Bacto triptona,
- Extracto de Levadura
- NaCl
Procedimiento
Medio Liquido Lb (1 L)
- 1. Mezclar 10 g de Bacto triptona, 5 g de extracto de Levadura y 10 g de NaCl en 950 mL de agua dionizada en un matraz de 1 Litro.
- 2. De ser necesario ajustar el pH del medio a 7.0 usando 1N NaOH y posteriormente aforar a 1 Litro
- 3. Autoclavear en ciclo liquido por 20 minutos a 15 psi.
- 4. Al salir de la autoclave esperar a que el medio se enfríe hasta el punto donde sea soportable agarrarlo con la mano.
- 5. Si es requerido agregar antibiotico.
- 6.Usar o guardar a temperatura ambiente o a +4°C.
Cajas de LB agar ( 1 L = Aprox 50 cajas)
- 1. Mezclar 10 g de Bacto triptona, 5 g de extracto de Levadura 10 g de NaCl y 15g de agar en 950 mL de agua dionizada en un matraz de 1 litro
- 2. De ser necesario ajustar el pH del medio a 7.0 usando 1N NaOH y posteriormente aforar a 1 Litro
- 3. Autoclavear en ciclo liquido por 20 minutos a 15 psi.
- 4. Al salir de la autoclave esperar a que el medio se enfríe hasta el punto donde sea soportable agarrarlo con la mano.
- 5. Si es requerido agregar antibiotico y vertir el medio en las cajas petri.
- 6. Esperar a que el medio se solidifique
- 7. Una vez solificiadas usar o guardar.
Part 2: Preparación de Celulas quimiocompetentes
Materiales
- Hielo
- Tubos eppendor 1 -2 ml
- Solución de 50mM cacl2
- Glicerol
- Centrifuga
- Tubos falcon 50ml
- Espectrofotómetro
Protocolo
- 1. Crecer E.coli (DH5α) por 18 horas (Over night) en LB líquido a 37°C.(Paso realizado en Día 0)
- 2. Tomar un mililitro del del cultivo over night y transferir a 100 ml de LB en un matraz de 250 ml.
- 3. Incubar 2 horas a 37°C y medir la Densidad Optica a 600 nm hasta alcanzar un valor de 0,25-0,8.
- 4. Transferir 40 mL a 1 tubo falcon (2 tubos de 40 mL cada uno) y centrifugar 10 minutos a 4°C a 3000 RPM.
- 5. Remover el sobrenadante y resuspender el pellet en 16 ml de CaCl2 50 mM frio a cada tubo de 40 mL.
- 6. Incubar en hielo 45 minutos, centrifugar 5 minutos a 4°C a 3000RPM.
- 7. Remover el sobrenadante y resuspender el pellet en 1,6 mL de solucion de CaCl2 50 mM Glicerol 15 % frio (170 mL de solución CaCl2 50 mM + 30 mL de Glicerol).
- 8. Alicuotar en tubos eppendorffs estériles de a 100 µL cada uno y conservar a -80°C o usar inmediatamente
