Introsynbio:Modulo 1:Dia2
Modulo 1: Principios de Ingeniería Genetica
Transformación bacteriana
Transformación Bacteriana
la transformación genética de bacterias es un procedimiento de laboratorio por el cual se introduce material genético a una bacteria. Existen otros procesos de inserción del material genético, que dependiendo del organismo receptor y el mecanismo, algunos reciben nombres como transfección o transducción. Generalmente, el material genético insertado es conocido como plásmido (DNA circular), pero pueden insertarse otras formas de material genético, como DNA o RNA. Los plásmidos utilizados para la transformación de bacterias contienen en general, uno o varios genes de interés, un gen reportero (que permite visualizar la transcripción del plásmido), y un gen de resistencia a un antibiótico, que permite seleccionar a la bacteria transformada de otras, por su capacidad de crecer en medio que contiene el antibiótico de resistencia.
Transformación por Heatshock
Theory
Artificial transformation is a process whereby E.coli are made competent and take up DNA from their surroundings. The main steps are chilling the cells to 0oC with CaCl2 solution, adding the DNA and heat shocking the bacteria for a short period of time, allowing the cells to recover at 37oC and then plate them.
One hypothesis for artificial transformation is that the divalent cation provided by the chilled CaCl2 solution which is used in creating competent cells promotes an interaction between DNA and lipopolysaccharides which are also negatively charge. Lipopolysaccharides occur in higher densities near the parts of the outer membrane of Gram negative bacteria that are in close association with the inner membrane (zones of adhesion).
It is believed that prior to incubation DNA may interact with lipopolysaccharides and then cross the 'least barrier path' at the zones of adhesion described above.
En Clase
Parte 1:Transformación por Método de Heatshock
Materiales
- Hielo
- Baño Maria a 42C
- Celulas Competentes
- ADN
- Cajas petri con Agar Lb y antibiótico (Cloranphenicol 25ug/ml)
Protocolo
- 1. Descongelar las células competentes preparadas el día 1 en hielo hasta que se vean liquidas (aproximadamente de 20 a 30 minutos).
- 2. Atemperar las placas de agar con antibiótico a temperatura ambiente.
- 3. Mezclar 1-5 µl de ADN (usualmente de 10 pg a 100 ng) en 100 µl de células competentes en un tubo de microcentrífuga y mezclar suavemente.
- 4. Incubar la mezcla células-ADN 20-30 minutos en hielo.
- 5. Incubar en un baño a 42°C por 30-60 segundos.
- 6. Incubar en hielo por 2 minutos.
- 7. Agregar 1 ml de medio LB o SOC e incubar a 37°C con agitación por 1 hora.
- 8. Centrifugar a 16000x g por 1 minuto. Descartar 850 µl del sobrenadante y resuspender el pellet en los 150 µl restantes.
- 9. Sembrar en placas de LB agar que contienen el antibiótico correspondiente.
- 10. Incubar las placas a 37°C por una noche.
