QiaGen's kit protocol

מידע מהhandbook: הקיט מיועד לבידוד DNA כרומוזומלי בגדול של 20-150 kb

(איור 1 עמוד 8)

מתוך עמוד 13- הקיט מכיל בופרים שממיסים את מרכיבי התא, הכל קורה על גבי המסננת של הטיפ 20/G שעשוי שרף וקושר את הDNA בתנאי מלח וPH מתאימים, לכן יש להימנע מייבוש המסננת. חלבונים וזיהומים בעלי משקל מולק' נמוך נשטפים עם בופר בריכוז מלח בינוני, הDNA משתחרר עם בופר עתיר מלח ואז מתגבש למשקע על ידי תגובה עם איזופרפנול. ליזאט המרוקן נטען על קצה הטיפ מראש. תנאי מלח וPH של הליזאט והסלקטיביות של המסננת מבטיחה שרק הDNA נקשר- RNA , חלבונים ומטבוליטים שלא נשמרים נשטפים בזרימה. את הטיפ שוטפים עם בופר QC (מלח בינוני) שמסיר לחלוטין את כל המזהמים שנותרו כמו עקבות של RNA וחלבונים (למשל RNase A) מבלי להשפיע על הקישור של הDNA. הבופר QC גם משבש אינטראקציות לא ספציפיות ומאפשר של חלבונים קושרים לחומצות גרעין ללא שימוש בפנול. ריכוז אתנול נמוך בבופר השטיפה מבטל דברים הידרופוביים לא ספציפיות מה שיותר משפר את טוהר הדגימה. הDNA נפלט בקלות מהטיפ על ידי בופר עתיר מלח QF- לעוד מידע עמוד 66 KIT - QIAGEN GENOMIC DNA BUFFER SET העלון שמגיע עם הקיט + השלמות שלי 1. יש לקנות בנפרד: כלים: טיפים G/20 בעלי מסננת עם חומר שעוותי שקושר את הDNA ומאפשר את השטיפות שלו בבופרים השונים. מבחנות זכוכית 10 מל אולי לא חייב זה לא ממיס את הפלסטיק ומעבר המבחנות לא עושה טוב. אולי יש זכוכית לצנטרפוגה? טיפים עם מסננת כדי שלא נזהם את הפיפטות. בופרים: בופר TE בPH 8-8.5 Isopropanol אתנול בטא מרפתנולאתנול אינזימים: RNase- אבקה במקרר תמיסה במקפיא- מבקע RNA חד גדילי PROTEASE QIAGEN - שומרים אותו עד 6 חודשים בטמפ' החדר ומעבר לכך לשים ב2-8 מצ. ביקוע קשר פפטידי (הרס חלבונים) על ידי הידרוליזה. QIAGEN PROTEINASE K- יציב בטמפ' החדר לשנה אחת. אחסון לטווח ארוך ב2-8 מצ. משבית נוקלאזות שעלולות לאכול את הDNA . (עיכול חלבון והסרת זיהומים) (לנו כתוב לאחסן את התמיסות המהולות במינוס 20 מצ, מקפיא). 2. מגיע עם הקיט: את הKIT ניתן לאחסן בטמפ' החדר עד שנתיים (לטווח ארוך לשים במקרר) - מלבד את בופר Y1 אותו יש לאחסן בטמפ' 2-8 מצ (מקרר). לנו יש אותו כבר 4 חודשים בטמפ' החדר. בופר G2 – להרחיק מאקונומיקה, מכיל גואנידין Hcl – להיזהר לעבוד עם כפפות, במנדף, חלוק. לפני הפעלת בופר QF יש לחממו ל50 מצ. ולקרר 1 מל אתנול 70% 1. להכין דגימות של תאים לפי הפרוטוקולים שבHandbook. 2. שמ בטיפ G/20 עם 1 מל בופר QBT להניח לטיפ להתרוקן לבד דרך המסננת. 3. לעשות ווטרקס במהירות מירבית לדוגמאות 10 שניות ואז לשים אותה עם הGenomic Tip המאוזן 4. תשטוף את הטים G/20 עם 3X1 מל בופר QC 5. לשטוף את הטיפ G/20 עם 2X1 מל בופר QF 6. תוסיפי 1.4 מל (0.7 volumes) של isopropanol בטמפ' החדר (15-25 מצ) לדנא. תשקיעי את הדנא ותשההי ב0.1-2 מל של תמיסת בופר (TE בופר PH8או - 10Mm Tris Cl PH8.5 להשקיע את הדנא על ידי היפוך המבחנה 10-20 פעמים, ולשלוף את הדנא בעזרת מוט זכוכית, מיד העבר את הדנא ה'מסולסל' לבמחנת מיקרוצנטריפוגה המכילה בופר. לחלופין, ניתן להשקיע את הדנא על ידי ערבוב וצנטריפוגה מיד ב5000 g למשך 15 דקות ל4 מצ. הסר בזהירות את הנוזל העליון . לשטוף את הפלט של הדנא שיצא מהצנטרפוגה ב1 מל אתנול קר 70%. תעשי ווטרקס קצר וצנטריפוגה ב5000g למשך 10 דקות ב 4 מצ. תסירי בזהירות את הנוזל העליון מבלי להפריע לפלט של הדנא. תייבש באוויר ל5-10 דקות ותשהה מחדש את הדנא בבופר. 7. לפרק את הדנא למשך לילה על השייקר ב55 מצ למשך 1-2 שעות . להשהות את פלט הדנא על ידי שיטפות הדפנות כדי לשחרר את הדנא. יש להימנע מפיפיטינג של הדנא מלעלה ומטה כדי לזרז את התהליך

פרוטוקול להפקה משמרים עמוד 37: נועד לDNA גנומי בגודל של 20 - 100 KB.

הכנות (טבלה 8 עמוד 40): 1. תמיסות אינזימים: RNase A – מגיע 100 מג/מל במקרר- מוהלים ב1 מל ומקבלים 100 מג במל (תמיסת סטוק - לשמור במקפיא ל 6 חודשים). מעכלRNA חד גדילי. Lyticase- מומס במים ריכוז סופי של 1000 מל /U (תמיסת סטוק- לשמור במקפיא)- מעכל דופן Proteinase K- מעכלים פורטאזות- מומס במים 20 מג/מל (תמיסת סטוק-לשמור במקפיא) (עמוד 64). משבית נוקלאזות שעלולות לאכול את הDNA . מעכל חלבון וזיהומים כל מין שמרים מעדיף אינזים אחר בעמוד 65 יש פירוט על העדפות. 2. בופרים: בופר Y1 (עושים פעם אחת) 160 מל בופר Y1 + 160 מיקרוליטר ביטאמרקפתנואתנול -מסריח, עבודה במנדף סגור, כפפות, חלוק. לשמור במקרר 2-8 מצ. ולסמן וי על הבקבוק. בופר G2 RNase 4 מיקרוליטר (בריכוז 100 מג/מל) + 2 מל בופר G2 - לריכוז של 200 מג/מל לקרר אתנול 70% (1 מל עבור כל דוגמא) לחמם בופר QF ל50 מצ (2 מל עבור כל דוגמא)

בדיקת ריכוז תאים למל לקביעת נפח התחלתי ריכוז תאים 108 X3 - 109X 1.5 (תאים/מל)- זה הריכוז שצריך בהתאם לסוג הטיפ 20/G לא לעשות יותר מזה כי ישנה את כל הזמנים ויסתום את המסננת. עמוד 15 טבלה 2- מצוין שהם הפיקו מ- 109X 1.5 תאים התחלתים כ- 18-20 מיקרוגרם והגיעו ל260/280 של 1.87. הריכוז תאים שלנו יש הוא-

אני לקחתי 1 מל ויצא לי כ-50 מיקרוליטר - 1.7. במומצע (לא כולל CT2) יש לי 08+E1.94 תאים ב1 מל. זה מתחת למינימום. היתי צריכה לקחת 7.749 מל.

• תופעת PK וPH – יש שני סוגים- לדעתי או 2 סוגי רבייה או פטריה נוספת.

קצירת תאים: 3. צנטריפוגה ב3000-5000 ב4 במצ למשך 5-10 דקות.

לזרוק את הנוזל שמעל המשקע.

4. הוסף 2 מל בופר TE למשקע ותעשי ווטרקס- שטיפה שמבטלת את המרכיבים של המדיה.

5. צנטרפוגה ב3000-5000 g ב4 מצ ל5-10 דקות. היפטר מהנוזל שמעל המשקע. תוסיפי למבחנה 1 מל מבופר Y1 (לעבוד במנדף). בופר זה מעכל את ממברנת התא. ווטרקס במהירות מרבית. חשוב שיהיה הומוגני 6. תוסיפי 100 מיקרוליטר של lyticase (1000 U/ml) ותעשי אינקובציה ב30 מצ ל30 דק

הליקטאז מעכל את הדופן

7. צנטרפוגה 5000g ב4 מצ ל10 דקות אחרי ששמתי ליקטאז מעכל דופן 8. השהה מחדש את המשקע + הנוזל ב2 מל של בופר G2 (שמכיל RNase A) ולערבב על ידי היפוך של המבחנה כמו פעמים או כמה שניות ווטרקס (תקפידי להוסיף RANase A לבופר G2 מראש לפי שלב 2) חשובה הומוגניות של התערבות! בופר G2 מסנן את הגרעינים וחלבונים כמו נוקלאזות, היסטונים וחלבונים אחרים הקשורים לDNA. עודף פורטאז עלול לעכל את החלבונים הדנטורטיביים לשברים קטנים. לערבב את המשקע עם הנוזל- פשוט להוסיף 2 ml בופר G2 (סהכ יש לך עכשיו 3 מל) 9. תוסיפי 45 מיקרוליטר Proteinase K ותעשי אינקובציה ב50 מצ למשך 30 דקות . לעבוד באמבט חם. מעכל פרוטאזות. משך דגירה תלוי ביעילות שלב 8. אם זה לא הומוגני תעשי ווטרקס ודגירה ארוכה יותר . 10. צנטרפוגה 5000 g ב4 מצ למשך 10 דקות . שמור את הנוזל תשליך את המשקע. 2 מל

עכשיו קיבלתי משקע לבן של פסולת תאית (לזרוק) ו2 מל נוזל נטול חלקיקים(לשמור).

11. המשך עם עמוד 49. יש לטעון מהר את הנוזל בטיפ המגניב שקנינו. אם מתמהמהים הוא יתקע בגלל משקעים ואז יש לבצע צנטריפוגה או סינון כדי למנוע סתימה של המסנן של הטיפ.

המשך עמוד 49- פרוטוקול עבודה עם טיפים גנומיים: Protocol: Isolation of Genomic DNA from Blood, Cultured Cells, Tissue, Yeast, or Bacteria using Genomic-tips לא לתת למסננת להתייבש ולא לנסות לזרז את התהליך. במנדף: 1. שמ של הטיפ 20/G עם 1 מל של בופר QBT ולאפשר למבחנה להתרוקן. 2. תעשי ווטרקס 10 שניות במהירות מרבית לדוגמאות משלב 12 ושימי את זה הישר על המסנן של הטיפ הזרימה צפויה להיות 4-10 טיפות / min. מתחת לטיפ מבחנת זכוכית לקחת 300 מיקרו ליטר להרצה בגל לקחתי אחרי השמ – לא יהיה DNA 3. לשטוף את הטיפ המגניב עם 3 X 1 מל של בופר QC . אפשר גם 2 שטיפות לקחת 120 מיקרו ליטר להרצה בגל פה לא יהיה DNA 4. במבחנה חדשה לשחרר את הDNA הגנומי עם 2X1 מל של בופר QF שחומם ל50 מצ מבחנה חדשה של 10 מל השימוש בפלסטיק לא מומלץ- זה לא עמיד בפני אלכוהול. אז בופר QF הוא זה שמשחרר את הDNA לקחת 120 מיקרו ליטר להרצה בגל 5. שטוף את הDNA על ידי הוספת 1.4 מל ( 0.7 volumes= 70%. לך יש 2 מל בופר QC לכן שימי 1.4 מל איזופורפנול ) isopropanol בטמפ' החדר להמסת הDNA תפעל לפי שלב 5A או 5B 5.A) תהפוך את המבחנה 10-20 פעמים ושלוף את משקע הDNA באמצעות מוט זכוכית ותמשיך לשלב 6A 5.B) לחלופין, ערבבו ותעשו מיד צנטריפוגה ביותר מ5000 g למשך 15 דקות ב4 מצ. תסירו בזהירות את הנוזל שמעל המשקע ותמשיכי לשלב 6B. להעביר למבחנת פלסטיק בשביל צנטרפוגה זה הכוח המינימלי עבור משקעים יעילים. מומלץ g יותר גבוה אם אפשר. למשקע ה Isopropanol סימון החלק החיצוני של המבחנה לפני הצנטריפוגה יאפשר לאתר את המשקעים בקלות. משקע ה Isopropanol יהיה גם מחובר בצורה רופפת לצד המבחנה ויש להיזהר בהסרת הנוזל. 6. העבר חומר לפי שלבים 6A ו 6B 6.A) מיד תעבירי את הDNA המסולסל למבחנה המכיל 0.1 2 מל בופר TE ממיסים את הDNA במהלך הלילה על משקשק / ב55 מצ למשך 1-2 שעות 6.B) שטוף את משקע הDNA מהצנטריפוגה עם 1 מל של אתנול 70% קר. וורטקס קצב וצנטריפוגה ביותר מ5000g 1- דק ב4 מצ. בזהירות תסירי את הנוזל העליון מבלי להפריע למשקע. לא ניראה משקע תייבשי באוויר למשך 5-10 דקות ותשהי מחדש את הDNA ב0.1 -2 מל בופר TE 20 מיקרוליטר. ממיסים את הDNA לילה על המשקשק / ב55 מצ למשך 1-2 שעות. אתנול 70% מסיר את המלח ומחליף את האיזופרופנול עם אתנול נדיף- מה שהופך את הDNA קל יותר להמסה מחדש. שטיפה שניה עם אתנול קר70% עשויה לשפר את התוצאות. לאחר הסרה זהירה ומוחלטת של האתנול שנוזל מעל המשקע עם פיפטה יש לייבש את המשקע לזמן קצר באוויר לפני ההשעיה מחדש בנפח קטן יותר של הבופר הבא. ייבוש יתר יקשה על משקע הDNA להתמוסס מחדש. תשהה מחדש את הDNA על ידי שטיפת הקירות . כדי לשחזר את כל הDNA במיוחד אם נעשה שימוש במבחנת זכוכית. תמנעי מפמפום עם הפיפטה! DNA מתמוסס הכי טוב בתנאים מעט בסיסים PH8-8.5 ולא מתמוסס בקלות בובפרים חומציים. קביעת תפוקה טוהר ואורך הדנא: בשביל לקבל 25-50 ng של DNA/µl (A260 = 0.5 -1) אל תדלל עם יותר מ4 volumes בופר. השתמש בבפור או במים כדי לדלל דגימות. ג'ל אלקטרופורזה PFGE באמצעות גל אגרוז- 1.5% agarose gel in 0.5x TBE electrophoresis buffer; switch intervals, 1 10 s; run time, 16 h; voltage, 170 V.

Analytical gel- עמוד 53 כדי לנתח את התהליך ולהבין למה קיבלתי ריכוז נמוך- לקחת מנה של כל אחת מהדגימות במקומות שמצוינים בפרוטוקול. להוסיף לדוגמאות 0.7 volumes של isopropanol לשטוף את המשקע עם 70% אתנול ולנקז היטב בלי צנטרפוגה אחרי האיזופורפנול? לשטוף את המשקע עם 70 % אתנול ולייבש. להשהות ב20 מיקרוליטר של בופר TE PH8 והוסף את הבופר המתאים השתמש ב10 מיקרוליטר מהדוגמאות לניתוח על גל אגרוז 0.5% . הפעל את הג'ל על bromophenol blue ותכתים אותו לזמן קצר באתידיום ברומיד.

1 Kb Plus DNA Ladder מיועד לDNA בטווח 100-15,000 bp. אידאלי לגל 0.8-1%. לטעון 0.1-0.2 מיקרוגרם של dna ladder לכל בארית ברוחב 1 ממ. אם לא מתעסקים עם שיבוטים תוסיפי את האתיודיום הברומיד לתוך הג'ל לתוך האמבטיה. הבופר באמבטיה צריך לכסות לגמרי את הג'ל .

להכין 1 מיקרוליטר DNA ladder ו1 מיקרוליטר מהמיץ הכחול ו8 מיקרוליטר מים- זה מתאים ל0.2 מיקרו דנא