User:Filipa Ribeiro C. Lucas/Notebook/Filipa Lucas/2010/05/04

Questões

1. Quais as características básicas que um vector plasmídico deve ter?

Os vectores de clonagem são materiais biológicos essenciais para levar a cabo uma estratégia experimental de clonagem de DNA (fazer cópias). São moleculas de Dna circular (plasmídeos) que ocorrem naturalmente em muitas espécies bacterianas. Esses plasmídeos são úteis para a expressão de genes de qualquer organismo na célula hospedeira de onde foram originalmente extraídos, pelo facto de nela serem capazes de replicar, de forma independente do cromossoma.

Elementos importantes:

- Origem de replicação para poder gerar um nº de cópias elevada (que vai desnaturar, permitindo as Dna polimersas da bacterias copiarem-o. A replicação leva a produzir mais DNA) - Gene de resistência à penicilina (crescem mais rápido. seleccionar as bactérias que incorporam o Dna. P mata todas as bactérias que não têm o plasmideo lá dentro - divisão aleatória: passado algum tempo já não teriam o plasmídeo. Gene de resistência é uma enzima (proteina codificada no vector e é expresssa. - Sitios de clivagem (local de policlonagem): para tornar mais fácil (flexibilidade) o seu manuseamento (MCS). Está a cortar ao meio uma região transcrita: LacZ (bases para a proteína ser expressa). Ver se as colónias tÊm a cor certa permite inferir se a clonagem correu bem.

Os plasmídeos possuem uma região, designada origem de replicação, que é essencial para a sua replicação e que assim assegura a sua transmissão à descendência da célula bacteriana. É pois crucial que esta região não seja alterada no processo de clonagem. Nos vectores de clonagem deverão ainda estar presentes regiões que codifiquem proteínas que permitam evidenciar certas características com vista à identificação rápida e assim a selecção das células que os contenham: marcas genéticas de selecção.

2. Os vectores podem ser representados pela sua sequência de DNA ou por mapas que incluem a indicação dos elementos mais relevantes presentes no vector.

Pesquise no google imagens dos vectores pUC, pGEX, pcDNA, pEGFP e o sistema pTre/pTet-On. Que diferentes características apresentam estes vectores e para que servem?

Puc: 1º Vector a ser utilizado comercialmente.Bactérias (E coli). Vector procarioticos (por causa dos promotores e origem de replicação).

Pgex: Vector procariotico (Lac) local de clonagem, origem de replicação, gene de resistência e locais de corte da enzima de restrição e está organizados por codões (parece que vai codificar proteínas). Quadros de leitura estão organizados para formar proteína de fusão com uma determinada enzima (GST-proteína). Trombina: proteína que promove a coagulação (protease-cliva o fibrinogénio. Separa os peptidos e ficar con os aa de interess). Purificação por afinidade. Permite produzir proteinas com grande facilidade e purifica-las.

PcDna:Vector eucariotico, é mais complexo, gene de resistência a neomicina (mata células eucarioticas. Da para integrar em células procarioticas e ser seleccionada lá. Exrpressando este gene para ser posteriormente integrado: clinhas celular estáveis. Células mantida. Citomegalovirus: virus de mamiferos (promotores de virus de mamiferos + local de poliadenilação: pode ser expresso em células humanas: eucarioticas). Clonagem em bacterias + purifcar + transferido pa celulas eucarioticas.

Pegfp:vector com promotor (citomegalovirus) + local policlonagem + seq codifica a proteina flurescente + sinal de poliadenilação + origem de replicação (bacteriana para permitir a clonagem). Qualquer gene inserido pode ser expresso em celulas eucarioticas (cauda poliA) como fusao flurescente -> estudar células vivas (respostas imunitárias, origem dos tecidos imunitários. isolar tumor humano, seleccionar as celulas de tumor flurescentes e inserir em ratinhos: ver progressao das metastases e como começam a crescer. Permite terapia génica). Problema: conseguir chegar o vector asc élulas adultas.

Sistema: criar vector de expressao indutivel (pode não estar a produzirr proteina e com estimulo começa), ou seja, ligar ou desligar a expressão génica através de repressores ou indutores.

3. De que forma é que um vector plasmídico é mantido na célula alvo?

4. Para além de vectores de DNA simples como os plasmídeos, podem-se construir vectores mais complexos com base em vírus, facilitando a entrada das sequências desejadas nas células alvo. Entre estes, os vectores retrovirais são muito utilizados por permitirem a integração estável do DNA no genoma da célula alvo. Se tivesse que construir um destes vectores, como faria para garantir que não há perigo de infecção e doença?