User:Gaston Paris:Notebook/Vectores pK19mobSacB

Idea General

Clonar en pK19mobSacB los fragmentos flanqueantes de los siguiente genes:

• LOV-HK de Brucella
• BAB1_1671 de Brucella

Clonar en el vector pSac las regiones flanqueantes de los siguientes genes:

• RR2 de Rhizobium
• RR5 de Rhizobium

En este caso se clonaran con los genes de resistencia Km y Spectinomicina.

Chequeo

Δ1671 esta Ok. Los oligos corresponden a lo esperado. Se espera un fragmento de 325 pb para la región 5' y 329 pb para la región 3'.

PCR para amplificar fragmentos (20/11/09)

	X1	MIX X4.5
Primer FWD 10 μM	5μL	- μL
Primer REV 10 μM	5μL	- μL
gDNA Brucella 100 ng/μl	1μL	4.5μL
10X Buffer pfu	7.5μL	33.75μL
dNTPS 2 mM	5μL	22.5μL
pfu FIL	1μL	- μL
H2O	25.5μL	114.75 μL

A cada tubo se agregaron 5 μL de primer FWD y 5 μL de primer REV, 39 μL de MIX y 1 μL de Pfu FIL. Se largo en PCR IVEMA (Lab302) con los siguientes ciclos:

• 5' a 94°C
• Seguido de 35 ciclos de:
  • 30" a 93°C
  • 1' a 55°C
  • 1' a 68°C
• 10' a 72°C de extensión final

Los tubos se rotularon:

• 1671 5' con los oligos 1671_5_FWD_Eco y 1671_5_REV
• 1671 3' con los oligos 1671_3_FWD y 1671_3_REV_Eco
• BaLOV 5' con los oligos BaLOVHK_5_FWD_Bam y BaLOVHK_5_REV
• BaLOV 3' con los oligos BaLOVHK_3_FWD y BaLOVHK_3_REV_Bam