User:Margarida Azevedo/Notebook/Margarida Azevedo/2010/05/11

Project name

Main project page Previous entry      Next entry

Entry title Questões 1. Enquanto uma célula eucariótica apresenta duas cópias de cada gene, uma bactéria pode conter 700 cópias de um plasmídeo. Considerando que o organismo humano adulto tem 1013 células e que 1 ml de cultura de bactérias tem 5x109 células/ml, compare o número de cópias de um gene que pode extrair de uma pessoa e do plasmídeo presente num litro de cultura de bactérias. 2.1. Acabou de obter o DNA codificante para uma proteína humana e pretende produzir essa proteína em bactérias. Qual dos vectores escolheria para efectuar a clonagem? Justifique. Vector B. Para o gene poder ser transcrito é necessário a existência do promotor. 2.2. O fragmento de DNA codificante para esta proteína foi obtido em duas versões, que apenas diferem na sequência das extremidades: Qual dos fragmentos codificantes para a proteína humana escolheria para inserir no vector? Justifique, tendo em conta a sequência do local de policlonagem. Se utilizarmos apenas uma enzima de restrição o vector poderá fechar sobre si próprio ou o gene pode ficar invertido. Com a utilização de 2 enzimas vamos obter 2 fragmentos e temos a certeza que não ocorrerá inversão (extremidades não idênticas). 3. Suponha que tem um projecto para realizar um trabalho de biologia molecular. Num primeiro passo você pretende clonar um fragmento de DNA num vector que permita a expressão da proteína codificada. O vector escolhido foi o pEGFP. Ambos, fragmento a clonar e vector a usar, são ilustrados na figura. 3.1 Diga como faria esta clonagem. Consegue assegurar que o fragmento seja introduzido na posição correcta para a expressão da proteína? Usar uma só enzima de restrição BAM HI, porque a extremidade gerada pelo corte da ECO RI não se ligaria à extremidade do fragmento inserido. 3.2 Como procederia para resolver o problema? Utilizaria outro vector, que tivesse outro local de policlonagem, onde actuasse uma enzima de restrição que permitisse que as extremidades ligassem (logo não ocorreria inversão). 3.3 Após crescer as bactérias transformadas numa placa com antibiótico, você amplificou uma colónia em cultura líquida, conseguiu purificar plasmídeo recombinante e fez a experiência que propôs, indo de seguida analisar o resultado por electroforese. A fotografia do gel que obteve é a seguir apresentada. Na pista 1 está o marcador lambda x HindIII (com bandas de )23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027 e 564 bp; na pista 2 o plasmideo digerido com EcoRI; na pista 3 o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1; e na pista 4 o plasmideo não digerido. Interprete os resultados obtidos. A sua clonagem funcionou ou não? A clonagem funcionou. Como podemos observar na terceira pista, o plasmideo digerido com EcoRI e Kpn1 originou dois fragmentos, o que indica que este foi bem integrado.