User:Pedro Matos/Notebook/Aulas Biologia Molecular 2010/2010/04/20

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TP5-PCR e RT-PCR (continuação) Questões Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita a identificação das mutações presentes no gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. Partindo de uma amostra de esfregaco da mucosa bucal de cada um dos familiares processamo-la, isto e, usamos acido para destruir as membranas celulares e depos neutralizamos a solucao ficando com DNA em solucao. A essa solucao adicionamos: os primers forward TCTGGAGACGCAGGAAGAGATCC e o reverse GCAGAATCCAGATGCTCAAGGCCC DNA polimerase, Deoxinucleotidos, Tampão, Água Cloreto de Magnesio. Depois com o produto de PCR fazemos a sequenciacao usando os primers: CATATTCTGGAGACGCAGGA (5’ → 3’) TGTACACATATTGACCAAATCAGG (5’ → 3’) ATGGGACGCTTGATGTTTTC (5’ → 3’) GGCATAAAAGTCAGGGCAGA (5’ → 3’) Compararia os resultados das 3 amostras. Proponha com detalhe adequado um procedimento experimental que permita o estudo da expressão do gene da beta-globina na família do nosso caso de estudo. Partindo de uma amostra de esfregaco da mucosa bucal de cada um dos familiares processamo-la, isto e, usamos acido para destruir as membranas celulares e depos neutralizamos a solucao ficando com RNA em solucao. A essa solucao adicionamos: o primers CTTTCTTGCCATGAGCCTTC Transcriptase reversa, Deoxinucleotidos, Água, Tampão Cloreto de Magnésio. Desta reacção obteríamos cDNA que depois usaríamos numa reacção de PCR com: Primers RIGHT primer: CTTTCTTGCCATGAGCCTTC LEFT primer: TCTGTCCACTCCTGATGCTG DNA polimerase, Deoxinucleotidos, Tampão, Água Cloreto de Magnesio. Depois com o produto de PCR fazemos a sequenciacao e comparamos os resultados