UA Biophysics:Protocols:Calcein8 ESP

Calceina: 800 mOsM, 50 mM, 50 ml, pH 7.4

Materiales:

• Probeta 100 ml
• 30 ml de NaOH (1M)
• HCl (1M)
• NaCl
• 1.5564 g de calceina
• 40 ml Buffer H:
  • 5 ml de EDTA 0.2 mM (Para que quede a 0.01 mM en la solución final)
  • HEPES 238.3 mg (para que quede a 10 mM en la solución final).

Procedimiento:

1. En la probeta medir 10 ml de NaOH 1M y colocar agitador
2. Disolver en el NaOH 1.5564 g de calceina (50 mM o 50 mOsM)
3. Agregar 200 mM de NaCl (400 mOsM)
4. Agregar los 20 ml de Buffer H a la calceina (10 mM o 10 mOsM)
5. Ajustar pH con NaOH y/o HCl 1M teniendo cuidado de medir el volumen agregado.

• El pH inicial debe estar alrededor de 9
• Se agrega HCl, si el color cambia verde el pH debe estar por debajo de 7 y se debe agregar NaOH.

1. Determinar la concentración de HCl y NaOH. Por ejemplo, si entre los dos se agregaron 0.84 ml a 1M, entonces la concentración es de 16.8 mM y aporta 16.8 mOsM provenientes de los iones Cl y/o Na.
2. Con el cálculo osmolaridad se determina la cantidad de NaCl para agregar. En este caso hacen falta 123.2 mOsM para completar los 800 mOsM, entonces como por cada molécula de cloruro de sodio hay 2 iones, se debe agregar sal para que la solución quede a 61.6 mM.
3. Sacar el agitador y completar los 50 ml

Ejemplo

Material	MW (g/mol)	[] mM	mOsM	Cantidad
NaOH	--	200	200	10 ml
NaCl	58.44	200	400	--
Calceina	622.55	50	50	1.5564 g
Buffer H	--	10	10	20 ml
NaOH + HCl	--	16.8	16.8	0.84 ml
NaCl	58.44	61.6	123.2	179.9 mg

Nota: almacenar a 4°C en frasco ambar

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