UA Biophysics:Protocols:Calcein ESP

Calceina: 400 mOsM, 50 mM, 100 ml, pH 7.4

Materiales:

• Probeta 100 ml
• 30 ml de NaOH (1M)
• HCl (1M)
• 3,113 g de calceina
• 40 ml Buffer H:
  • 5 ml de EDTA 0.2 mM (Para que quede a 0.01 mM en la solución final)
  • HEPES 238.3 mg (para que quede a 10 mM en la solución final).

Procedimiento:

1. En la probeta medir 20 ml de NaOH 1M y colocar agitador
2. Disolver en el NaOH 3,113 g de calceina (50 mM o 50 mOsM)
3. Agregar los 40 ml del Buffer H a la calceina (10 mM o 10 mOsM)
4. Ajustar pH con NaOH y/o HCl 1M teniendo cuidado de medir el volumen agregado.

• El pH inicial debe estar alrededor de 9
• Se agrega HCl, si el color cambia verde el pH debe estar por debajo de 7 y se debe agregar NaOH.

1. Determinar la concentración de HCl y NaOH. Por ejemplo, si entre los dos se agregaron 23 ml a 1M, entonces para un buffer de 23 ml la concentración es de 23 mM y aporta 23 mOsM provenientes de los iones Cl y/o Na.
2. Con el cálculo osmolaridad se determina la cantidad de NaCl para agregar. En este caso hacen falta 110 mOsM para completar los 400 mOsM, entonces como por cada molécula de cloruro de sodio hay 2 iones, se debe agregar sal para que la solución quede a 55 mM.
3. Sacar el agitador y completar los 100 ml

Ejemplo

Material	MW (g/mol)	[] mM	mOsM	Cantidad
NaOH	--	200	200	20 ml
Calceina	622.55	50	50	3.113 g
Buffer H	--	10	10	40 ml
NaOH + HCl	--	30	30	3 ml
NaCl	58.44	55	110	321.4 mg

Nota: almacenar a 4°C en frasco ambar

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